Montando un laboratorio de biología molecular por 1000€

Realizar prácticas de laboratorio en los colegios siempre resulta complicado y cuando las hacemos solemos tener que recurrir a cosas sencillas ya que los presupuestos son bastante ajustados.

Mi objetivo cuando empecé a dar clases en segundo de bachillerato fue poder montar un laboratorio de microbiología y biología molecular, haciéndolo con un presupuesto muy ajustado.

Para montar un laboratorio de biología molecular es necesario un equipamiento básico, dando por hecho que un laboratorio de un colegio ya tiene unos materiales mínimos.

Después de pensar me di cuenta de que lo realmente necesario era:

• Micropipetas. Necesarias para poder trabajar con volúmenes muy pequeños. Decidí que sería necesario usar una pipeta de 0,1 -10 µl y otra de 20 – 200 µl. El precio aproximado de las dos pipetas, buscando por internet es de unos 180 €. Además, compré pipetas pasteur pequeñas para realizar los protocolos de extracción de ADN y poder ir retirando el sobrenadante (unos 12 €).

• Tubos Eppendorf. Hay que comprar de 1,5 ml para hacer los procesos de extracción de ADN y de 0,2 ml para realizar la PCR.

Microcentrífuga adquirida. Llega hasta 13.000 rpm.

• Microcentrífuga. Es imprescindible para realizar una extracción y purificación de ADN de células humanas. Mirando por eBay, se pueden encontrar de segunda mano en Estados Unidos por unos 130€ (Hay que tener cuidado con los cargos de aduanas y con la corriente eléctrica, esto supone algunos dolores de cabeza eligiendo convertidores de tensión).

• Cubeta de electroforesis. Comprarla nueva es imposible ya que es carísima, decidí fabricarla yo con un tapper de cristal y fabricar también el peine. En realidad, hace la misma función. La miré por eBay y las había baratas, pero me daba miedo de que vinieran con bromuto de etidio sin limpiar correctamente y no me quería arriesgar.

• Power supply. También es imprescindible, se podría comprar en España en una tienda normal de electrónica, pero es muy cara. Lo mejor es comprarla en eBay de segunda mano, yo la conseguí de USA por unos 70€.

• Reactivos PCR. Es la parte más cara y son imprescindibles. Hay que comprarlos. Realmente es una parte delicada porque tienes que comprar todos los reactivos, asegurarte de que no te falte nada, tener una nevera y un congelador para guardarlo. También debes de buscar los primers que necesitas y pedirlos (estos son muy baratos, a unos 10€ por pareja de primers).

• Termociclador. Aunque parezca mentira es una parte prescindible. Un termociclador “simplemente” calienta unos baños a distintas temperaturas. Se puede hacer poniendo unos vasos de precipitados y calentándolos con mecheros bunsen, con un termómetro para mantener constante la temperatura y un alumno en cada vaso mirando constantemente la temperatura y ajustando el mechero para mantenerla constante.

• Agarosa. Es un poco cara, unos 25gr vale 25€, pero puedes usarlos para hacer unos 15-20 geles. Tengo que probar si usando agar (que es muy barato) se obtienen los mismos resultados.

• Lámpara UV. Un transiluminador es muy caro, pero se puede usar una lámpara para detectar billetes falsos que vale unos 20€ ya que el la longitud a la que se excita el GelRed es similar al que emiten estas lámparas.  ¿Cómo saber si con esta lámpara tan barata se podían ver bandas de ADN?, decidí pedirle a una amiga que preparase un Gel en su laboratorio y probar si funcionaba. Vi que se podían ver las bandas (de forma un poco más difícil que con un transiluminador profesional, pero esta lámpara cuesta unas 500 veces menos que uno profesional).

• GelRed (BrEt). Es un intercalente de ADN imprescindible para poder visualizar el ADN. Hasta hace unos años solo existía el Bromuro de Etidio que es muy cancerígeno. Esto es imposible de usar en un laboratorio de un colegio. La aparición del GelRed con la misma función intercalante pero sin la capacidad de atravesar las membranas celulares y por lo tanto la incapacidad de afectar tejido vivo hace que solo afecte al DNA que queda fuera. Este producto es algo caro, pero lo he conseguido mediante donación de un amigo (aun así puedes conseguirlo por unos 100€).

La idea es enseñar a mis alumnos de 2º de bachillerato las técnicas básicas con las que se trabaja en un laboratorio de biología molecular y reproducir el protocolo de identificación de ADN usado por la policía científica (el CSI español). Se trata de realizar extracción y purificación de ADN, PCR para amplificación de vTNR para identificación de perfiles genéticos,  electroforesis en gel de agarosa y análisis de resultados.

Es importante elegir bien las secuencias que se quieren amplificar. Después de leer y preguntar decidí usar dos secuencias: el VNTR D1S80 y una inserción ALU (TPA25).  Los primers son muy baratos (unos 25€ los dos), pero el pedido hay que hacerlo con la secuencia, es decir, tienes que investigar la secuencia y enviarla, no es muy difícil si has trabajado en este campo y tienes algo de experiencia.

La inserción ALU es muy fácil de visualizar en una electroforesis porque genera una banda 400pb o una de 100pb, aunque es muy poco polimórfico (solo presencia o ausencia). El VNTR D1S80 es muy polimórfico pero al generar bandas con muy pocos pb de diferencia es difícil de visualizar con nuestro laboratorio “casero”. Por este motivo, aunque he comprado el primer para probar a usarlo algún día, he decidido usar solo la inserción ALU con mis alumnos.

Es importante tener amigos en laboratorios que te puedan suministrar pequeñas cantidades de algún reactivo que sería muy caro para comprarlo y solo necesitamos muy poco, como el tampón de extracción o el tampón TBE.

La práctica la dividimos en tres días. Puedes descargarte los protocolos usados

Manos a la obra:

Lo primero que realizamos fue la extracción del DNA usando el siguiente protocolo.

Un alumno muestra el DNA.

1.     Raspar el interior de la mejilla vigorosamente con un palillo

2.     Colocar el palillo en un tubo eppendorf limpio y añadir 1 ml. de agua destilada. Agitar vigorosamente durante unos segundos. Retirar el palillo y centrifugar en microfuga durante 45 segundos.

3.     No alterar el pellet. Si esto ocurre, centrifugar otra vez.

4.     Eliminar todo el agua posible sin alterar el pellet.

5.     Agitar en en tubo eppendorf en 200 ml de tampón de extracción. Añadir otros 400 ml de tampón de extracción y agitar el tubo vigorosamente.

6.     Incubar a 65 °C durante 10 min.

7.     Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min.

8.     Transferir todo sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf con cuidado de no alterar el pellet.

9.     Añadir un volumen igual de isopropanol frío por la pared del tubo (300 ml) y mezclar con cuidado.

10.  Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min.

11.  Vaciar los tubos nada más salir de la centrífuga, con cuidado de no eliminar el precipitado.

12.  Secar el precipitado durante varios minutos dejando el tubo abierto para que se evapore el isopropanol.

13.  Observar el DNA como un precipitado blanco en el fondo del tubo.

14.  Añadir unos 500 ml de etanol al 70% (hasta unos 2/3 del tubo), agitar vigorosamente hasta que se resuspenda el pellet y centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos.

15.  Vaciar los tubos nada más salir de la centrífuga, con cuidado de no eliminar el precipitado.

16.  Secar el precipitado durante varios minutos dejando el tubo abierto para que se evapore el etanol.

17.  Observar el DNA como un precipitado blanco en el fondo del tubo.

18.  Se pueden repetir los pasos los pasos del 14 al 17 para purificar el DNA.

19.   Resuspender en 50 ml de agua destilada y estéril y guardar a -20ºC hasta su utilización.

Guardamos el DNA suspendido en agua destilada en el congelador.

El siguiente paso fue realizar la PCR. Para ello, preparé una maxtermix usando los siguientes parámetros para el número de reacciones que tenía que realizar.

Component	Final Concentration (indicaciones)	POR REACCIÓN
5X Green or Colorless GoTaq® Flexi Buffer1	1X	10 µl
MgCl2 Solution, 25mM1	1.0mM	2 µl
PCR Nucleotide Mix, 10mM each	0.2mM each dNTP	1 µl
upstream primer (100 microMolar)	1.0μM	0,5 µl
downstream primer (100 microMolar)	1.0μM	0,5 µl
GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase (5u/μl)	1.25u	0,25 µl
template DNA	<0.5μg/50μl	20 µl
Nuclease-Free Water to		15,75 µl
	Volumen total	50 µl

Use los parámetros que me daban en la casa comercial y elegí un volumen de 50 µl para el total de la reacción y un buffer con color para poder trabajar mejor y reducir la posibilidad de evaporación mientras realizaba la PCR. Además, decidí usar la menor cantidad de cloruro de magnesio que fuese posible, ya que temía que se me inhibiese la reacción por exceso de sal, al haber usado un método de extracción de DNA “sucio”.

Los alumnos repartieron la mastermix en tubos de PCR con sus muestras de DNA.

Puse tres vasos de precipitados en tres mecheros bunsen con un termómetro y un alumno que controlaba la temperatura y fuimos cambiando los tubos de la PCR de baño en baño. Hicimos 25 ciclos siguiendo los siguientes parámetros:

·      94ºC  4 min.

·      94ºC  1 min., 60ºC 2 min., 72ºC 2 min.,  25 ciclos

·      72ºC 10 min.

Para sujetar los tubos de PCR y cambiarlos de baño en baño utilicé una tapa de nocilla agujereada.

Los alumnos se turnaban para vigilar las temperaturas y el resto iba preparando medios de cultivo para hacer las practicas de microbiología, ya que tenían que preparar el medio y plaquearlo ellos y además preparar medios adicionando antibióticos.

El producto obtenido de la PCR lo guardamos en el congelador para la siguiente práctica donde realizaríamos la electroforesis.

Para realizar la electroforesis preparé un gel de agarosa al 2% en TBE. El molde para el gel fue un tupper de plástico recortado y el peine para hacer los pocillos una lamina de plástico recortada.

Cargamos las muestras y las dejamos correr bajo los siguientes parámetros durante unos 30 minutos y observamos los resultados con la lámpara de UV para detectar billetes falsos.

La verdad es que este es el momento clave y crítico. Lógicamente, primero había probado a hacer yo la práctica y después de unas cincuenta horas de preparación, comprar materiales, buscar secuencias posibles para amplificar, buscar y probar diferentes protocolos de extracción, distintas concentraciones de todo... para poner la práctica a punto no sabia si iba a obtener algún resultado y este es el momento mas bonito al ver que efectivamente, después de todo, teníamos resultados.

Lo cierto es que el sabor de boca que te queda después de hacer esto es bastante bueno y los alumnos se sorprenden de lo que es en realidad trabajar en biología molecular.

La forma de terminar el trabajo fue preparar un informe tipo artículo científico (con el esquema típico de cualquier artículo científico). Elegí el mejor articulo, le hice de referee al alumno para pulirlo y lo publicamos en la revista del colegio.

Ahora estoy pensando que más me puedo plantear hacer...

Aquí tenéis el protocolo que usamos en las prácticas.